Inhoud
Lise is een Grieks woord en betekent gewoon "verdelen" of "ontbinden". Het is een goede beschrijving van de reactie die optreedt bij cellen in een lysisbuffer, een oplossing die ze afbreekt om hun inhoud te extraheren. Wetenschappers gebruiken deze oplossingen om bij celanalyse DNA of eiwitten te extraheren, vooral in het geval van bacteriën. Het type cellysisbuffer varieert afhankelijk van het type experiment, maar we zullen enkele veelvoorkomende keuzes noemen.
Buffer en zout
De bufferoplossingen stabiliseren de pH, terwijl de cellen het lysisproces ondergaan. De tris-HCL-oplossing is de meest gebruikelijke buffer voor buffering bij pH 8, als de pH gewenst is. HEPES is een andere veelgebruikte bufferoplossing in deze experimenten. Natriumchloride kan ook worden toegevoegd om de ionsterkte te verhogen, de totale concentratie van opgeloste stoffen buiten de cellen. Dit laatste is belangrijk omdat water zich naar alle celmembranen kan verspreiden, van gebieden met een lage concentratie opgeloste stoffen tot gebieden met een hoge concentratie.
Wasmiddel
Wasmiddel is het belangrijkste ingrediënt dat het celmembraan oplost zodat de inhoud kan ontsnappen. Detergentia zijn amfipatische moleculen, dat wil zeggen dat het ene uiteinde gemakkelijk in wisselwerking staat met watermoleculen, terwijl het andere hydrofobe uiteinde, of "dat bang is voor water", die interactie niet doet. Ze kunnen vetten oplossen door micellen, kleine groepen, te vormen, waarbij de hydrofobe staarten van de wasmiddelmoleculen naar binnen wijzen naar de vetmoleculen. Gebruikelijke wasmiddelen zijn natriumdodecylsulfaat of SDS, NP-40 en tritonX.
Chelaatvormers en remmers
Lysisbuffers bevatten meestal ook chelaatvormers zoals ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) of retyleenglycoltetraazijnzuur (EGTA). Deze chemicaliën binden zich aan metaalionen met een +2 lading (bijvoorbeeld magnesium en calcium), waardoor ze niet beschikbaar zijn voor andere reacties. Veel DNA-en (eiwitten die op DNA kauwen) en proteasen (eiwitten die andere eiwitten afsnijden) hebben magnesiumionen nodig om te werken, dus door hen dit hoofdbestanddeel, EDTA en EGTA, te onthouden, helpen ze het niveau van protease of van DNAse-activiteit. Ze sluiten ze echter niet volledig uit, en sommige proteasen zijn niet afhankelijk van magnesiumcofactoren, dus lysisbuffers bevatten soms ook stoffen die proteaseremmers worden genoemd, die eraan binden en ervoor zorgen dat het niet goed werkt.
Alkalische lysis
Alkalische lysis is een veel voorkomende techniek om plasmiden uit bacteriën te zuiveren. Deze methode impliceert het gebruik van drie oplossingen. De eerste bevat glucose, tris-HCL-buffer, EDTA en RNAses. Glucose zorgt voor een hoge concentratie opgeloste stoffen van buitenaf, waardoor deze enigszins slap worden, wat het lysisproces vergemakkelijkt. EDTA en tris-HCL werken zoals eerder beschreven, terwijl RNAse elk RNA in de cel kauwt om het uit de weg te ruimen. De tweede oplossing voert effectief cellysis uit. Het bevat het detergens SDS en NaOH, dat de pH verhoogt tot 12 of hoger, waardoor eiwitten in de cel worden denaturerend en het DNA zich in eenvoudige filamenten laat scheiden. De derde oplossing bevat kaliumacetaat om de pH naar een meer neutraal niveau te herstellen, zodat de plasmide-DNA-strengen samen kunnen komen. Ondertussen komen de gedenatureerde eiwitten samen en slaan ze neer, terwijl de dodecylsulfaationen zich verbinden met de kaliumionen om een onoplosbare verbinding te vormen, die ook uit de oplossing kan neerslaan.