Inhoud
Agarosegelelektroforese is een wetenschappelijke procedure die wordt gebruikt in onderzoeks- en diagnostische projecten waarbij nucleïnezuren worden bestudeerd. Hiermee kan de wetenschapper of technicus de geladen nucleïnezuurmoleculen, zoals DNA, scheiden op basis van hun grootte en wordt het gebruikt om de producten te analyseren die door het experiment zijn gegenereerd, zoals de polymerasekettingreactie. Het wordt routinematig gebruikt omdat het goedkoop is om uit te voeren, snel te verwerken en herstel van het te analyseren nucleïnezuur mogelijk maakt.
De gel maken
Verzamel alle benodigde items en maak ze schoon met 70% ethanol. Items omvatten gel-gegoten schaal, plakband, agarose van laboratoriumkwaliteit, flessen of cilinders, 10x concentratie (Tris-Boraat-EDTA, TBE) runbuffer, ethidiumbromide, kleurstof en het te analyseren monster. Zorg er ook voor dat je een gelelektroforese reservoir en krachtbron hebt. Agarose wordt bereid door de juiste hoeveelheid DNA-tape te wegen die moet worden geanalyseerd, het te mengen met de TBE-buffer en te smelten in de magnetron. Over het algemeen is een 1% tot 2% oplossing voldoende om veel DNA-strengen bestreken in de dagelijkse moleculaire biologie te dekken. Kleine DNA's vereisen meer geconcentreerde gels, terwijl grotere DNA's meer verdunde gels vereisen. De agarose-oplossing wordt gemengd met ethidiumbromide, dat zal binden aan het nucleïnezuur tijdens de elektroforese-procedure. Deze oplossing wordt in de smeltschaal van de gel gegoten, net zoals een vormkam wordt ingebracht en men laat het mengsel stollen.
Plaats en activeer de gel
De gel wordt uit de schaal verwijderd en ondergedompeld in een gelelektroforese reservoir dat runbuffer bevat. De te analyseren monsters worden gemengd met kleurstoffen en in putjes in de door de kam gemaakte gel geplaatst. Een marker of schaal is ook opgenomen om de onderzoeker in staat te stellen de voortgang van de elektroforese te zien en de grootte van de gevormde fragmenten te bepalen. Vervolgens wordt een elektrische stroom op de gel aangebracht, die het monster dwingt om van het ene uiteinde van de gel naar het andere te migreren. Tijdens dit proces scheiden de nucleïnezuren in het monster zich in fragmenten van verschillende groottes, waarbij grotere moleculen dichter bij de put komen en kleinere moleculen naar het andere uiteinde van de gel bewegen.
Analyseer de gel
Na beëindiging van de elektroforeseprocedure wordt de gel uit het reservoir verwijderd en in een UV-transilluminator geplaatst, die de nucleïnezuurfragmenten verlicht die aan het fluorescerende ethidiumbromide binden. Een foto hiervan wordt gemaakt en de banden van de nucleïnezuren kunnen worden gemeten volgens de afstand die door de gel is gemigreerd. De schaal scheidt ze in banden van bekende groottes en kan worden gebruikt om de onderzoeker tijdens de analyse te begeleiden.