Inhoud
- Detectie met behulp van kleurwijzigingen
- Een ELISA-lezer gebruiken voor metingen
- Direct concurrerende ELISA (cytochrome c)
- Incubeer het primaire antilichaam in tubes
De ELISA-test is een enzymgebonden immunosorbenttest die antilichamen of antigenen gebruikt die zijn gekoppeld aan een specifiek enzym om de concentratie van antilichaam of antigeen te helpen bepalen. Als u een ELISA gebruikt en geen specifieke antilichamen kunt gebruiken om uw resultaten te verkrijgen, wordt competitieve ELISA voorgesteld omdat het een antigeen gebruikt geconjugeerd aan een enzym in plaats van het antilichaam en een andere detectiemethode.
Detectie met behulp van kleurwijzigingen
Een gebruikelijk protocol voor de competitieve ELISA is om een niet-gemerkt en gezuiverd primair antilichaam te gebruiken. Het antilichaam bekleedt de putjes van een microtiterplaat en wordt geïncubeerd met onbekende standaarden. Een immunogeen wordt vervolgens toegevoegd om te conjugeren met het primaire antilichaam, dat zal binden aan de antilichaamplaatsen die nog niet zijn bezet. Een substraat wordt vervolgens gebruikt om een kleurverandering te creëren om de bindingsconcentratie te meten.
Een ELISA-lezer gebruiken voor metingen
Gebruik een microtiterplaat van polystyreen en voeg het primaire antilichaam aan elke well toe. Om de maximale binding te bereiken, vult u de well met één microgram van het antilichaam. Incubeer de plaat gedurende vier uur bij kamertemperatuur. Voeg het primaire capture-antilichaam toe en was de wells met PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing). Incubeer platen met blokkeerbuffer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Was de putjes tweemaal opnieuw met PBS en voeg de normen toe. Plaats de antigeenconjugaatoplossing in de wells en incubeer opnieuw gedurende twee uur. Was de plaat opnieuw vier keer met PBS. Voeg het substraat toe en meet de dichtheden op de specifieke golflengte met behulp van een ELISA-lezer.
Direct concurrerende ELISA (cytochrome c)
Voor een direct competitieve ELISA moet een serumverdunningsanalyse worden uitgevoerd voor het antigeen dat u in het experiment gebruikt. De microtiterplaat wordt vervolgens bekleed met cytochroom c en gedurende de nacht geïncubeerd. Het ELISA-gedeelte van de test wordt vervolgens uitgevoerd door toevoeging van blokkeerreagens en secundair antilichaam. Absorptieresultaten worden gelezen met een microplaatlezer.
Incubeer het primaire antilichaam in tubes
In deze procedure wordt het primaire antilichaam geïncubeerd in reageerbuizen waarin het antigeen van belang zich eraan bindt. De monsters worden vervolgens aan de putjes van de microtiterplaten toegevoegd en geïncubeerd. De putjes worden vervolgens gewassen om alle niet-gebonden antigeen-antilichaamcomplexen te verwijderen en vervolgens wordt de blokkerende oplossing toegevoegd om te voorkomen dat het tweede antilichaam aan de putjes bindt. Het secundaire antilichaam wordt vervolgens op een plaatlezer afgelezen om de resultaten te verkrijgen.