Inhoud
Elektroforese technieken scheiden DNA-moleculen op basis van hun grootte; soortgelijke technieken voor eiwitten kunnen ze scheiden op basis van grootte of lading. In beide gevallen wordt de gel waardoor de moleculen migreren bereid met een bufferoplossing, een chemische stof die de pH stabiliseert. De dop vervult verschillende vitale functies bij elektroforese.
stroom
De elektroforesegel werkt door een elektrische stroom op de ondergedompelde gelplaat in de buffer aan te brengen. De DNA-moleculen zijn negatief geladen en de eiwitten kunnen negatief worden geladen door ze eerst te denatureren en vervolgens te behandelen met natriumdodecylsulfaat (SDS). Eiwitten of DNA-moleculen migreren van de negatief geladen kathode naar de positief geladen anode. Water is echter een tamelijk slecht voertuig in stroom - het voert alleen stroom effectief als het stoffen erin oplost, omdat geladen ionen in een elektrisch veld bewegen. De bufferoplossing heeft een hogere ionconcentratie (hogere ionsterkte), waardoor deze veel meer stroom kan voeren dan zuiver water.
PH verandering
De pH meet de concentratie van het waterstofion. De verandering in pH kan de netto lading van moleculen veranderen, zoals eiwit of DNA, waardoor een langzamere (of snellere) migratie wordt veroorzaakt. Dat komt omdat deze moleculen basisonderdelen hebben die waterstofionen (protonen) en veel zure delen die protonen kunnen doneren accepteren. Wanneer een zuur een proton doneert, wordt het negatief geladen; wanneer een basis een proton accepteert, wordt het in tegendeel positief geladen. Naarmate de concentratie van waterstofionen in de oplossing toeneemt, worden eiwitten en DNA minder negatief geladen (of positiever geladen). De pH waarbij een molecuul, zoals eiwit, geen lading heeft, wordt een iso-elektrisch punt genoemd. Buffers stabiliseren de pH in de gel op een niveau waar het DNA negatief geladen zal zijn en zal naar wens migreren.
Gel stapelen
Buffers spelen een nog complexere rol in een soort elektroforese genaamd SDS-PAGE of natriumdodecylsulfaat, polyacrylamidegelelektroforese. Dit is een van de meest gebruikelijke technieken voor eiwitanalyse. Ze worden gedenatureerd door warmtebehandeling en vervolgens gecoat met natriumdodecylsulfaat en pas daarna toegevoegd aan de gel, die in het algemeen verticaal loopt. De gel heeft twee gebieden, die van het stapelen (in het hogere gedeelte) en die van eronder lopen. De stapelgel wordt bereid met een andere buffer, zodat de pH ervan lager is dan die van de loopgel, bovendien heeft deze een kleinere ionsterkte. Deze twee factoren veroorzaken stapeling van het eiwit, dus het gaat allemaal tegelijk in de loopgel. Dit effect zorgt ervoor dat de eiwitten in de gel worden gescheiden op basis van hun grootte.
Cap DNA-elektroforese
De twee meest voorkomende buffers voor DNA-gelelektroforese zijn tris-acetaat EDTA en tris-boraat EDTA, waarbij EDTA staat voor ethyleendiaminetetra-azijnzuur. Het is belangrijk omdat het dient als een chelator voor magnesiumionen, waardoor ze uit de oplossing worden verwijderd. Deze ionen zijn essentiële co-factoren voor enzymen die DNA worden genoemd en die DNA breken, dus EDTA in de buffer werkt als een extra voorzorgsmaatregel om problemen met DNA's te voorkomen.